聚乙烯亞胺PEI-Pro（GMP）是一種GMP級別的轉染試劑，其操作與維護指南主要包括以下內(nèi)容：

　　一、操作指南

　　1.貼壁細胞轉染操作

　　以6孔板轉染293T細胞為例：

　　轉染前準備：

　　轉染前一天：用膠原酶消化細胞并計數(shù)（不建議用胰酶）。按照每孔2×10^6的細胞量接種293T至6孔板（每孔加入2ml新鮮的DMEM:F12+5%FBS培養(yǎng)基和1ml的細胞懸液），置于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時。

　　24小時后，移除之前培養(yǎng)基，每孔加入2ml新鮮的DMEM:F12+5%FBS。注意確保293T細胞生長狀態(tài)良好，傳代不超過15代。

　　第一天：顯微鏡下檢查細胞匯合度，當細胞達到70%到80%的匯合度時，開始準備轉染。

　　轉染步驟：

　　對于每孔細胞，用100μl無血清培養(yǎng)基（如OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基）稀釋DNA，使DNA終濃度為1ug/ml（DNA/總培養(yǎng)體積）。

　　對于每孔細胞，用100μl無血清培養(yǎng)基（如OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基）稀釋適當比例的適量BIOHUB-PRO GMP。DNA與BIOHUB-PRO GMP的比例要根據(jù)實驗摸索最適比例。

　　將稀釋的BIOHUB-PRO GMP轉染試劑加入到稀釋的質粒中（總體積200μL），輕輕混勻，室溫孵育30分鐘。

　　小心地將BIOHUB-PRO GMP復合物滴加到細胞培養(yǎng)板每個孔中，輕輕搖動培養(yǎng)板混勻。注意加入混合液時輕輕沿著孔板邊緣滴入，避免破壞細胞的粘附性。

　　將培養(yǎng)板放入37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。

　　觀察轉染結果：

　　第二天：在熒光顯微鏡下觀察細胞轉染效率，通常超過80%的293T細胞在轉染后的24小時可以觀察到綠色熒光。

　　2.懸浮細胞轉染操作

　　以293F細胞于100mL培養(yǎng)瓶（溶液體積占瓶體積的1/5）操作體系為例：

　　細胞培養(yǎng)：

　　HEK293F細胞傳代接種于20mL懸浮細胞生長培養(yǎng)基中，在36.5℃、120rpm、5%CO2的條件下培養(yǎng)。當細胞密度達到1×10^6cells/mL時，旋緊瓶口放入搖床繼續(xù)培養(yǎng)，2~4小時后可以進行轉染。

　　轉染步驟：

　　用1mlOptiPRO?SFM（無血清培養(yǎng)基）稀釋適量的DNA，使DNA終濃度為1ug/ml（DNA/總培養(yǎng)體積）。混勻并靜置5分鐘。

　　用1mlOptiPRO?SFM（無血清培養(yǎng)基）稀釋適當比例的BIOHUB-PRO GMP，混勻并靜置10分鐘。

　　將BIOHUB-PRO GMP轉染試劑加入到稀釋的質粒中，輕輕混勻，室溫孵育30分鐘。

　　將BIOHUB-PRO GMP轉染復合物逐滴加入到細胞培養(yǎng)液中，搖勻后旋緊瓶口放回搖床（36.5℃、5%CO2、120rpm）。

　　基因表達檢測：

　　基因表達可在24~72小時后檢測，具體時間取決于細胞系和轉基因。
 

　　二、維護指南

　　1.儲存條件

　　PEI-Pro（GMP）轉染試劑建議儲存在低溫環(huán)境中，如4℃冰箱或-20℃冰凍條件下。低溫環(huán)境能夠有效延緩PEI分子結構的降解，保持其穩(wěn)定性。

　　避免PEI溶液的反復凍融，以保持其最佳狀態(tài)。

　　2.使用注意事項

　　PEI-Pro（GMP）轉染試劑的使用濃度是實驗效果的關鍵因素之一。一般建議將PEI溶液稀釋至適合的工作濃度后立即使用，避免長時間儲存稀釋后的溶液。

　　不同的細胞類型對PEI濃度的敏感度不同，實驗人員應根據(jù)具體細胞的需求進行優(yōu)化，以提高轉染效率。

　　若發(fā)現(xiàn)PEI溶液出現(xiàn)沉淀、渾濁或顏色變化，可能意味著其已發(fā)生降解，建議此時更換新的試劑，以確保實驗結果的準確性。

　　3.定期驗證

　　長期保存的PEI-Pro（GMP）轉染試劑在使用前應進行小規(guī)模實驗驗證其轉染效率是否依然符合要求，這樣可以避免浪費實驗材料和時間。

　　4.更新與替換

　　對于經(jīng)常需要使用PEI-Pro（GMP）轉染試劑的實驗室，建議定期更新儲存的試劑，并按照生產(chǎn)商的建議進行正確的儲存和使用。

　　通過以上操作與維護指南，可以確保聚乙烯亞胺PEI-Pro（GMP）轉染試劑在細胞轉染實驗中的有效性和穩(wěn)定性，提高實驗結果的準確性和可重復性。